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只需5分钟,快速准确地定量蛋白质
点击次数:3次 发布时间:2018-12-05 返回

        上海88必发娱乐官网报道:BCA法是最常用的蛋白定量方法之一,但有同学吐槽,“30分钟的孵育时间太长了”。的确,在核酸定量无需一分钟的前提下,蛋白质定量却要在37°C下孵育30分钟,或在室温下孵育2小时,的确显得太过漫长。

        在蛋白质的提取、纯化和分析过程中,蛋白质的定量随处可见。比如在裂解细胞之后,我们对各个样品中的蛋白进行定量,方便下游应用中的平行比较;而在蛋白电泳之前,我们也需要准确定量,以免精心准备的电泳(特别是2D电泳)抱憾而归。鉴于不同的蛋白样品中可能存在各种各样的(干扰)组分,测定蛋白浓度的方法也有许多种。

        最简单的方法是测定蛋白样品在280 nm处的紫外吸光度。带有芳香族侧链的氨基酸(即酪氨酸、色氨酸)表现出强烈的紫外线吸收,故通过测定A280可以确定蛋白浓度。然而,这种方法虽然简单,却不太可靠,因为每种蛋白质的氨基酸组成并不同。此外,许多在280 nm处有光吸收的物质也会造成干扰,如核酸、小分子物质和某些去污剂。因此,这种方法多用于纯化的蛋白质的定量。

        对于未完全纯化的蛋白、低丰度蛋白或细胞裂解液的浓度测定,基于试剂的蛋白定量方法就成为首选。在蛋白样品中加入定量试剂,在适当的波长下监测样品的颜色变化,并与已知浓度的对照蛋白质进行对比,即可测定蛋白质的浓度。

为何选择BCA?

        BCA法就是近年来最常用的方法之一,目前Google学术搜索已有14万条结果。这种方法又被称为Smith法,因为它是由Pierce公司的Paul K. Smith等人在1985年发明的。后来,Pierce公司被赛默飞世尔科技公司收购。当然,这是后话。

        BCA法的基本原理是,蛋白质在碱性环境下与Cu2+络合,并将Cu2+还原为Cu1+。通过两个BCA分子与还原态Cu1+的螯合,可形成紫色的显色反应产物。该产物在562 nm处有较高的吸光值,并与蛋白质浓度呈正比。

        与Bradford或Lowry等方法相比,BCA法对去垢剂的兼容性更强。它与多数离子型或非离子型去垢剂兼容,也是膜蛋白检测的首选方法。常用浓度的去垢剂,比如SDS、Triton X-100、Tween 20等,都不影响检测结果。还原剂、螯合剂以及强酸或强碱,则会干扰Cu2+的还原反应。

        此外,BCA法有着高度的均一性。相对于Bradford染料结合方法而言,不同蛋白质之间的变异性更小。它还具有高的线性度,BSA的线性范围在20至2000 µg/mL。即使是低至5 µg/mL的样品,通过改良操作也能灵敏检测。不知道如何改良?那可以试试赛默飞的Micro BCA Protein Assay Kit,它是专为检测稀释样品的蛋白浓度(0.5-20 µg/mL)而设计的。

        不过,有同学吐槽,“30分钟的孵育时间太长了”。的确,在核酸定量无需一分钟的前提下,蛋白质定量却要在37°C下孵育30分钟,或在室温下孵育2小时,的确显得太过漫长。如果经常要定量蛋白质,这个时间成本可伤不起。

快一点,再快一点

        基于这个理由,赛默飞推出了全新的Pierce™ Rapid Gold BCA蛋白定量试剂盒。顾名思义,它能够更省时。现在,只需在室温下孵育5分钟,并在480 nm下测定,即可获得准确的定量结果。

        Pierce Rapid Gold BCA试剂盒的原理与标准BCA法相同,也是基于Cu2+的还原反应和BCA与Cu1+的螯合。不过,反应产物是橙金色复合物,在480 nm处有强烈的光吸收。与标准方法相比,它有着同样的线性范围,可以定量20至2000 µg/mL的蛋白质。在去垢剂兼容性和定量均一性方面,它的表现也是同样出色。

        重点来了!它只需在室温下孵育5分钟哦,不需要准备水浴箱,也不需要等待半小时。同时,需要的样品量较少。每次分析只需20 μL,而标准BCA分析是25 μL。它可用来评估细胞裂解液的蛋白产量,预计膜蛋白的回收率,以及在工业应用中监控蛋白污染。

        当然,没有一种测定蛋白质浓度的方法是完美的,因为每种方法都会受到不同条件的影响,如缓冲液组分的干扰,紫外吸收实验中的杂质蛋白等。我们在选择定量方法时应考虑:与缓冲液组分的兼容性、蛋白质之间的均一性、检测范围、速度和便利性等因素。如果蛋白质浓度对研究非常重要,建议对比分析多种定量方法的结果。

        同时,88必发娱乐官网已成为国内生命科学领域ELISA试剂盒的主要供应商之一,代理许多国际先进水平的高科技试剂盒,包括分子生物学、细胞生物学、免疫学等多个研究及应用领域,期待能与更多科研单位深入合作,共同打造生物行业一片蓝天。

     

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