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小知识:ELISA实验双抗体夹心法实验原理及实验步骤
点击次数:5次 发布时间:2019-01-08 返回

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双抗体夹心法(常用于测定抗原)实验原理:

        用特异性抗体包被于固相载体,经洗涤后加入含有抗原之待测样品,如待检样品中有相应抗原存在,即可与包被于固相载体上的特异性抗体结合,经保温孵育洗涤后,即可加入酶标记特异性抗体,再经孵育洗涤后,加底物显色进行测定,底物降解的量即为欲测抗原的量。

双抗体夹心法实验步骤:
 
一、材料准备:

        1.实验材料:血清、血浆、体液

        2.实验仪器:酶标比色计、96 孔板、移液枪、离心管、离心管盒

        3.所需试剂及试剂盒:碳酸盐包被缓冲液、抗体球蛋白、吐温-20、柠檬酸、硫酸

       

二、实验操作方法:

        1.包被抗体:用包被缓冲液稀释特异性抗体球蛋白至最适浓度(1~10 μg /ml),每凹孔加 0.3 ml,4℃ 过夜,或 37℃ 水浴 3 小时,贮存冰箱。

        2.洗涤:移去包被液,凹孔用洗涤缓冲液(含 0.05% 吐温-20)洗 3 次,每次 5 分钟。

        3.每凹孔加入 0.2 ml 用稀释缓冲液稀释的含抗原的被检标本,37℃ 作用 1~2 小时。

        4.洗涤:移去包被液,凹孔用洗涤缓冲液(含 0.05% 吐温-20)洗 3 次,每次 5 分钟。

        5.加入 0.2 ml 用稀释缓冲液稀释的酶标记特异性抗体溶液,37℃ 作用 1~2 小时或由预试实验确定作用时间。

        6.洗涤:移去包被液,凹孔用洗涤缓冲液(含 0.05% 吐温-20)洗 3 次,每次 5 分钟。

        7.加入 0.2 ml 底物溶液于每个凹孔(OPD 或 OT),室温作用 30 分钟(另作一空白对照,0.4 ml 底物加 0.1 ml 终止剂)。

        8.加终止剂:每凹孔加 2M H2SO4 或 2 M 柠檬酸 0.05 ml。

        9.观察记录结果:目测或用酶标比色计测定(OPD 用 492 nm)OD 值。

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