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ELISA实验常用方法大讲解(2019最新)
点击次数:11次 发布时间:2019-03-26 返回

        ELISA是一种广泛应用在测定液体样本中的蛋白、抗体、或激素的免疫分析技术。酶联免疫吸附试验的标准程序,通常是把蛋白、抗体、或激素等(即抗原)直接或是以捕捉抗体(capture Ab)固定在固相载体上,再加入一级检测抗体(primarydetection Ab),形成一个抗原抗体的复合物。如果该抗体已经用酶(enzyme)标记了,即可用来直接测定抗原的量,若无,则可利用另一个酶标记的二级抗体来测定抗原的量。今天给大家讲解的是ELISA实验中的常见几大方法,一起来看看吧!

        在间接法和夹心法ELSIA中,阳性孔呈色深于阴性孔。在竞争法ELISA中则相反,阴性孔呈色深于阳性孔。两类反应的结果判断方法不同,分述于下。

        一、间接法和夹心法

        这类反应的定性结果可以用肉眼判断。目视标本也无色或近于无色者判为阴性,显色清晰者为阳性。但在ELSIA中,正常人血清反应后常可出现呈色的本底,此本底的深浅因试剂的组成和实验的条件不同而异,因此实验中必须加测阴性对照。阴性对照的组成应为不含受检物的正常血清或类似物。在用肉眼判断结果时,更宜用显色深于阴性对照作为标本阳性的指标。

        目视法简捷明了,但颇具主观性。在条件许可下,应该用比色计测定吸光值,这样可以得到客观的数据。先读出标本(sample,S)、阳性对照(P)、和阴性对照(N)的吸光值,然后进行计算。计算方法有多种,大致可分为阳性判定值法和标本与阴性对照比值法两类。

        a.阳性判定值

        阳性判定值(cut-off value)一般为阴性对照A值加上一个特定的常数,以此作为判断结果阳性或阴性的标准。

        用此法判断结果要求实验条件十分恒定,试剂的制备必须标准化,阳性和阴性的对照品应符合一定的规格,须配用精密的仪器,并严格按规定操作。阳性判定值公式中的常数是在这特定的系统中通过对大量标本的实验检测而得到的。现举某种检测HBsAg的试剂盒为例。试剂盒中的阴性对照品为不含HBsAg的复钙人血浆,阳性对照品HBsAg的含量标明为P=9±2ng/ml。每次试验设2个阳性对照和3个阴性对照。测得A值后,先计算阴性对照A值的平均数(NC X )和阳性对照A值的平均数(PCX),两个平均数的差(P-N)必须大于一个特定的数值(例0.400),试验才有效。3个阴性对照A值均应≥0.5×NCX,并≤1.5×NCX,如其中之一超出此范围,则弃去,而以另两个阴性对照重新计算NCX;如有两个阴性对照A值超出以上范围,则该次实验无效。阳性判定值按下式计算:

        阳性判定值=NCX+0.05

        标本A值>阳性判定值的为阳性,小于阳性判定值的为阴性。应注意的是,式中0.05为该试剂盒的常数,只适合于该特定条件下,而不是对各种试剂均可通用。

        根据以上叙述可以看出,在这种方法中阴性对照和阳性对照也起到试验的质控作用,试剂变质和操作不当均会产生"试验无效"的后果。

        b.标本/阴性对照比值

        在实验条件(包括试剂)较难保证恒定的情况下,这种判断法较为合适。在得出标本(S)和阴性对照(N)的A值后,计算S/N值。也有写作P/N的,这里的P不代表阳性(positive),而是病人(patient)的缩写,不应误解。为避免混淆,更宜用S/N表示。在早期的间接法ELISA中,有些作者定出S/N为阳性标准,现多为各种测定所沿用。实际上每一测定系统应该用实验求出各自的S/N的阈值。更应注意的是,N所代表的阴性对照是不含受检物质的人血清。有的试剂盒中所设阴性对照为不含蛋白质或蛋白质含量较底的缓冲液,以致反应后产生的本底可能较正常人血清的本底低得多。因此,这类试剂盒规,如N<0.05>(或其他数值),则按0.05计算,否则将出现假阳性结果。

        二、竞争法

        在竞争法ELISA中,阴性孔呈色深于阳性孔。阴性呈色的强度取决于反应中酶结合物的浓度和加入竞争抑制物的量,一般调节阴性对照的吸光度在1.0-1.5之间,此时反应最为敏感。

        竞争法ELISA不易用自视判断结果,因肉眼很难辨别弱阳性反应与阴性对照的显色差异,一般均用比色计测定,读出S、P和N的吸光值。计算方法主要也有两种,即阳性判定值法和抑制率法。

        a.阳性判定值法

        与间接法和夹心法中的阳性判定值法基本相同,但在计算公式中引入阳性对照A值,现举某种检测抗HBc的试剂盒为例。试剂盒中的阴性对照为不含抗HBc的复钙人血浆,阳性对照中抗HBc含量为125±100u/ml。每次试验设2个阳性对照和3个阴性对照。测得A值后,先计算阴性对照A值的平均值(NC X )和阳性对照A值的平均数(PCX),两个平均数的差(N-P)必须大于一个特定的数值(例如0.300),试验才有效。3个阴性对照A值均应小于2.000,而且应≥0.5×NCX并≤1.5×NCX,如其中之一超出此范围,则弃去,而以另2个阴性对照重新计算×NCX;如有2个阴性对照A超出以上范围,则该次实验无效。阳性判定值按下式计算:

        阴性判定值=0.4×NCX+0.6×PCX

        标本A值≤阳性判定值的反应为阳性,A>阳性判定值的反应为阴性。

        b.抑制率法

        抑制率表示标本在竞争结合中标本对阴性反应显色的抑制程度,按下式计算:

        抑制率(%)= (阴性对照A值-标本A值)×100%/阴性对照A值

        一般规定抑制率≥50%为阳性,<50%为阴性。

        定量测定

        ELSIA操作步骤复杂,影响反应因素较多,特别是固相载体的包被难达到各个体之间的一致,因此在定量测定中,每批测试均须用一系列不同浓度的参考标准品在相同的条件下制作标准曲线。测定大分子量物质的夹心法ELISA,标准曲线的范围一般较宽,曲线最高点的吸光度可接近2.0,绘制时常用半对数纸,以检测物的浓度为横坐标,以吸光度为纵坐标,将各浓度的值逐点连接,所得曲线一般呈S形,其头、尾部曲线趋于平坦,中间较呈直线的部分是最理想的检测区域。

        测定小分子量物质常用竞争法,其标准曲线中吸光度与受检物质的浓度呈负相关。标准曲线的形状因试剂盒所用模式的差别而略有不同。

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