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WB实验需要设置"内参"吗?
点击次数:9次 发布时间:2019-04-12 返回

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    WB实验是检测一个基因的表达产物是否正确,或者比较表达产物量的相对变化。Western Blot在有些人眼里做起来很简单,可实验不顺的时候经常会出现做不出结果、假阳性啦、结果出现多条带等情况。这到底是一抗有问题还是二抗有问题?所以,严谨的Western Blot实验设计中要求有良好的参照体系,对实验结果分析是非常有用的。

    内参即是内部参照,对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白,它们在各组织和细胞中的表达相对恒定,在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。在WB中使用内参其实就是在WB过程中的另外用内参对应的抗体检测内参,这样在检测目的产物的同时可以检测内参的表达,由于内参在各组织和细胞中的表达相对恒定,借助检测每个样品内参的量就可以用于校正上样误差,这样半定量的结果才更为可信。此外使用内参可以作为空白对照,检测蛋白转膜情况是否完全、整个WB显色或者发光体系是否正常。

    实验结果分析其实很简单:如果样品蛋白量有限,只够进行一次电泳转膜实验时,分别检测样品的内参量和目的蛋白量。将各样品目的蛋白量分别除以其内参含量,得到的数值即为内参校正后的各样品中目的蛋白相对含量,再用此数值进行样品间的比较和分析,得到目的蛋白含量在不同样品间的实际变化结果。如果样品量充分,可以先检测内参,观测样品间内参显色条带是否一致,根据差异大小调整各样品的上样量重新进行Western Blotting实验,至内参量一致为止;若内参一致,即可进行不同样品间目的蛋白表达变化分析。这样虽然麻烦一点,但是可以保证结果更有说服力,更可信。毕竟我们的实验是一种严谨的工作。

     常用的细胞总蛋白质内参有GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)和细胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin,这其中最近的国外文献报道中使用GAPDH内参的较多。对于一些植物的样本,则需要特别的植物Actin蛋白作为内参;同样的,如果提取的样本是细胞核蛋白,那么PCNA或者组蛋白H3都是被经常使用的;而针对一些研究线粒体的客户,那么Cox IV则被较多的文献引用作为线粒体总蛋白的内部参考。

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